Планарный микроэлектродный массив

Планарный микроэлектродный массив (англ. planar microelectrode array, pMEA) – представляет собой плоскую матрицу с расположенными на поверхности микроэлектродами (от десятков до тысяч), при помощи которой осуществляют внеклеточную регистрацию биоэлектрической активности нейронов в условиях in vitro (используются клеточные культуры или диссоциированные нейроны).

История

Разработка pMEA началась более 30 лет назад1 и продолжается с тех пор.2 Веха была достигнута, когда Pine в 1980 году впервые представил записи, полученные из культур диссоциированных нейронов (верхних шейных ганглиев у новорожденных крыс).3 Что делает работу Pine такой важной, так это то, что в ней сообщается об одновременной внутри- и внеклеточной регистрации нейрональной активности, что доказывает полезность pMEA для мониторинга нейрональных реакций. С тех пор различные группы разработали свои собственные плоские микроэлектродные матрицы456 и использовали их в сочетании с различными типами нейрональных клеточных культур.789 Наконец, технология pMEA была улучшена, когда стала возможной стимуляция нейронов.10 С тех пор исследование нейронных сетей стало важным инструментом как в фармацевтических экспериментах,11 так и в фундаментальных исследованиях.1213

Строение и виды планарных массивов

Как правило, микроэлектроды (точнее токосъемные поверхности) сделаны из золота и часто покрыты черной платиной,1415 чтобы снизить их сопротивление. Другие материалы, такие как нитрид титана, который обладает высокой нанопористостью, также используется для создания микроэлектродов. Межкомпонентные соединения часто изготавливаются из оксида индия и олова (Indium Tin Oxide, ITO), за счет своей прозрачности они обеспечивают возможность прямого наблюдения за клетками с помощью инвертированного микроскопа.16

Слой изолирующего материала должен соответствовать необходимым требованиям биосовместимости и устойчивости, особенно для долгосрочного изучения культур. До настоящего времени для этой цели было успешно использовано несколько материалов, включая SiO₂, Si₃N₄, полимеры, такие как полиимид, силиконовая смола,17 полиакриламид или SU-8.18 Эти материалы должны быть обработаны материалами, которые способствуют адгезии клеток. Наиболее широко используемыми молекулами являются полилизин, ламинин и полиэтиленимин.1920

Виды планарных мультиэлектродных массивов

Два типа стандартных pMEA

A: Планарный биочип MEA60. B: Планарная мультиэлектродная ванночка 64 (MED64) биочип

Мультиоэлектродный массив (англ. multi-electrode array, MEA) (8 × 8 массивов из 60 микроэлектродов) состоит из 60 микроэлектродов каждый диаметром 30 мкм, с межэлектродным расстоянием 200 мкм, размещенных на стеклянной подложке. Электроды сделаны из нитрида титана и соединенны с ленточными проводниками, состоящими из золотого проводящего слоя (Au). Изолирующее покрытие – нитрид кремния.

Мультиэлектродная ванночка (англ. multi-electrode dish, MED) (8 × 8 массивов из 64 микроэлектродов).2122 состоит из 64 микроэлектродов размером 50х50 мкм и межэлектродным расстоянием 100 мкм, расположенных на стеклянной подложке. Квадратные микроэлектроды изготовлены из черной платины + золото (Au) + никель (Ni) и соединены с ленточными проводниками из прозрачного оксида индия и олова. Изолирующее покрытие – полиакриламид.

Недавно были разработаны планарные массивы микроэлектродов высокой плотности (HD-MEA), основанные на технологии комплементарных металлоксидных полупроводников (CMOS), которые могут иметь до нескольких десятков тысяч электродов с клеточным и субклеточным пространственным разрешением.2324

Применение

Регистрация полевого возбуждающего постсинаптического потенциала (fEPSP)

(A) Фазоконтрастная микрофотография среза гиппокампа крысы, зафиксированного в pMED. (B) Парное импульсное облегчение вызванной реакции. Два двухфазных импульса подавались с интервалом 40 мс

Электроды измеряют потенциалы внеклеточного поля, генерируемые потенциалом действия, и могут также использоваться для стимуляции нервной клетки. pМEА обеспечивают неинвазивные, долгосрочные измерения для изучения нейронной активности.2526

➥Более подробно: Микроэлектродный метод измерения мембранного потенциала

Планарные МЕА широко используются для регистрации различных видов препаратов, начиная от культивируемых нейронов и органотипических срезов мозга и заканчивая диссоциированными срезами мозга. Последнее используется в исследованиях синаптической пластичности из-за следующих преимуществ:

  • Синаптические структуры в локальных областях мозга остаются относительно интактными;
  • Избегают модификации ткани или аберрантные связи, вызванные культурой;
  • Записи могут быть выполнены на тонких срезах мозга животных c моделированными заболеваниями головного мозга;
  • Записи МEА могут сочетаться с поведенческими и молекулярно-клеточными исследованиями;
  • Процедура экономит время.

Однако использование плоских МEА в диссоциированных срезах мозга может привести к менее стабильной записи из-за слоя мертвых клеток на поверхности среза, связанного с повреждением клеток во время изготовления среза, что приводит к низкому отношению сигнал/шум. Так называемый «слой мертвых клеток» обозначает границу среза (~ 50 мкм в глубину), на которой немногие клетки остаются активными после травмы и отека. Это формирует электрически пассивный слой, создающий шунт между pМEА и активными клетками внутри среза, что приводит к низкоамплитудному сигналу. Таким образом, уменьшение расстояния между записывающими электродами и активными клетками является хорошим способом получения высокоамплитудных сигналов, для решения этой проблемы используют 3D-MEA.

pMEA были использованы для взаимодействия нейронных сетей с небиологическими системами в качестве контроллера. Например, с использованием MEA может быть создан нейро-компьютерный интерфейс. Диссоциированные нейроны коры крысы были интегрированы в замкнутую цепь обратной связи стимул-реакция, чтобы управлять аниматом в виртуальной среде.27

Преимущества и недостатки

В целом основные преимущества планарных массивов по сравнению с более традиционными методами, такими как patch clamp, включают следующее:28 

  • Допускается размещение нескольких электродов одновременно, а не по отдельности;
  • Возможность установки нескольких электродов в качестве контроля и стимуляции, а других в качестве регистрирующих. Это представляет особый интерес в экспериментах со стимуляцией;
  • Возможность выбирать разные отведения в массиве, что позволяет контролировать коммутацию, разрешение и выбирать зоны регистрации сигнала;

Кроме того, массивы не повреждают клетку по сравнению с patch clamp, потому что они не требуют перфорации клеточной мембраны.

К недостаткам относится то, что pMEA менее пригодны для записи и стимуляции отдельных клеток из-за их относительно низкого пространственного разрешения по сравнению с patch clamp и dynamic clamp.

Сложность формы сигналов, которые электрод pMEA может эффективно передавать в клетки ограничена.

Footnotes

  1. Thomas, C., Springer, P., Loeb, G., Berwald-Netter, Y.,
    and Okun, L.: A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Exp. Cell Res., 74, 61–66 (1972).
  2. Potter, S.M.: Distributed processing in cultured neuronal networks. Prog. Brain Res., 130, 49–62 (2001).
  3. Pine, J.: Recording action potentials from cultured neurons
    with extracellular microcircuit electrodes. J. Neurosci. Methods, 2, 19–31 (1980).
  4. Novak, J. and Wheeler, B.: Recording from the aplysia abdominal ganglion with a planar microelectrode array. IEEE Trans. Biomed. Eng., 33, 196–202 (1986).
  5. Jimbo, Y. and Kawana, A.: Electrical stimulation and recording from cultured neurons using a planar microelectrode array. Bioelectrochem. Bioenerg., 29, 193–204 (1992).
  6. Cunningham, W., Mathieson, K., McEwan, F., Blue, A., McGeachy, R., McLeod, J., Morris-Ellis, C., O’Shea, V., Smith, K., Litke, A., and Rahman, M.: Fabrication of microelectrode arrays for neural measurements from retinal tissue. J. Phys. D Appl. Phys., 34, 2804–2809 (2001).
  7. Egert, U., Heck, D., and Aertsen, A.: Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Exp. Brain Res., 142, 268–274 (2002).
  8. Wirth, C. and Lücher, H.-R.: Spatiotemporal evolution of excitation and inhibition in the rat barrel cortex investigated with multielectrode array. J. Neurophysiol., 91, 1635–1647 (2004).
  9. Hofmann, F., Guenther, E., Hämerle, H., Leibrock, C., Berezin, V., Bock, E., and Volkmer, H.: Functional reestablishment of the perforant pathway in organotypic cocultures on microelectrode arrays. Brain Res., 1071, 184– 196 (2004).
  10. Gross, G., Rhoades, B., Reust, D., and Schwalm, F.: Stimulation of mmonolayer networks in culture through thin-film indium-tin oxide recording electrodes. J. Neurosci. Methods, 50, 131–143 (1993).
  11. Gholmieh, G., Courellis, S., Fakheri, S., Cheung, E., Marmarelis, V., Baudry, M., and Berger, T.: Detection and classification of neurotoxins using a novel short-term plasticity quantification method. Biosens. Bioelectron., 18, 1467–1478 (2003).
  12. Shahaf, G. and Marom, S.: Learning in networks of cortical neurons. J. Neurosci., 21, 8782–8788 (2001).
  13. Eytan, D., Brenner, N., and Marom, S.: Selective adaptation in networks of cortical neurons. J. Neurosci., 23, 9349–9356 (2003).
  14. Prasad, S., Yang, M., Zhang, X., Ozkan, C. S., and Ozkan, M.: Neurons as sensors: individual and cascaded chemical sensing. Biosens. Bioelectron., 19, 1599–1610 (2004).
  15. Bucher, V., Graf, M., Stelzle, M., and Nisch, W.: Low impedance thin-film polycrystalline silicon microelectrodes for extracellular stimulation and recording. Biosens. Bioelectron., 14, 639–649 (1999).
  16. Ziegler, C.: Cell-based biosensors. Fresenius J. Anal. Chem., 366, 552–559 (2000).
  17. Gross, G. W. and Kowalski, J. M.: Origin of activity patterns in self-organizing neuronal networks in vitro. J. Intell. Mater. Syst. Struct., 10, 558–564 (2001)
  18. Heuschkel, M., Guérin, L., Buisson, B., Bertrand, D., and Renaud, P.: Buried microchannels in photopolymer for delivering of solutions to neurons in a network. Sens. Actuators B, 48, 356–361 (1998).
  19. Chang, J. C., Brewer, G. J., and Wheeler, B. C.: Microelectrode array recordings of patterned hippocampal neurons for four weeks. Biomed. Microdev., 2, 245–253 (2000)
  20. James, C. D., Spence, A. J. H., Dowell-Mesfin, N. M., Rifat, J. H., Smith, K. L., Craighead, H. G., Isaacson, M. S., Shain, W., and Turner, J. N.: Extracellular recordings from patterned neuronal networks using planar microelectrode arrays. IEEE Trans. Biomed. Eng., 51, 1640–1648 (2004).
  21. Egert U, -Schlosshauer B, Fennrich S, Nisch W, Fejtl M, Knott T, et  al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus  on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Res Brain Res Protoc 1998, 2: 229–242.
  22. Oka H, Shimono K, Ogawa R, Sugihara H, Taketani M. A new  planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods 1999, 93: 61–67
  23. Frey, U. et al. Switch-Matrix-Based High-Density Microelectrode Array in CMOS Technology. Solid-State Circuits, IEEE J. 45, 467–482, doi:10.1109/JSSC.2009.2035196 (2010).
  24. Ballini, M. et al. A 1024-Channel CMOS Microelectrode Array With 26,400 Electrodes for Recording and Stimulation of Electrogenic Cells In VitroIEEE J. Solid-State Circuits 49, 1–15, doi:10.1109/JSSC.2014.2359219 (2014).
  25. Obien M.E., Deligkaris K., Bullmann T., Bakkum D.J., Frey U. Revealing Neuronal Function Through Microelectrode Array Recordings. Front. Neurosci. 2015;8:1–30. doi: 10.3389/fnins.2014.00423. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef[Google Scholar]
  26. Spira M.E., Hai A. Multi-Electrode Array Technologies for Neuroscience and Cardiology. Nat. Nanotechnol. 2013;8:83–94. doi: 10.1038/nnano.2012.265. [PubMed] [CrossRef[Google Scholar]
  27. DeMarse TB, Wagenaar DA, Blau AW, Potter SM. 2001. The Neurally Controlled Animat: Biological Brains Acting with Simulated Bodies. Autonomous Robots 11: 305-10.
  28. Whitson J, Kubota D, Shimono K, Jia Y, Taketani M. Multi-Electrode Arrays: Enhancing Traditional Methods and Enabling Network Physiology. In: Baudry M, Taketani M, eds. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. New York: Spring Press; 2006: 38-68