Электронно-измерительная аппаратура для микроэлектродных исследований
Электронно-измерительная схема для регистрации биоэлектрических параметров клеток обычно состоит из нескольких блоков. Эти блоки включают как промышленную электронно-измерительную аппаратуру, так и узлы, изготовляемые обычно самими экспериментаторами. В наиболее простом виде комплект электронно-измерительной аппаратуры для регистрации внутриклеточных биопотенциалов возбудимых тканей включает в себя усилитель для внутриклеточной регистрации биопотенциалов возбудимых тканей, измерительную систему, генератор прямоугольных сигналов (стимулятор), осциллограф.
Предварительный усилитель
Предварительный усилитель предназначен для передачи без искажений потенциала от клетки через микроэлектрод на осциллограф. Предварительный усилитель служит для соблюдения «правила соглаcования», т.е. он должен иметь высокое входное сопротивление (Rвх) и низкое выходное сопротивление (Rвых). При этом должно выполняться правило:
Rмэ + Rм <<Rвх , а Rвых<<Rвх осциллографа (1.2)
где Rмэ – сопротивление микроэлектрода, RМ – сопротивление мембраны клетки, Rвх осциллографа – входное сопротивление осциллографа.
В этом случае коэффициент усиления предварительного усилителя равен 1 или даже 0,95. Для получения точности измерений выше 1% должно быть выполнено соотношение Rвх>100 (Rмэ + Rм). Поскольку величина (Rмэ + Rм) обычно лежит в области 108 Ом, то для 1% точности измерений биопотенциалов Rвх должно быть не менее 1010 Ом. Этому требованию удовлетворяет ряд интегральных микросхем.
Усилители должны соответствовать как минимум нескольким требованиям, основные из которых сводятся к следующим:
- коэффициент усиления предварительного усилителя должен быть равен 1;
- должна быть предусмотрена цепь компенсации входной емкости;
- рабочий диапазон входных напряжений ±1 В;
- смещение постоянной составляющей должно регулироваться в пределах ±300 мВ;
- ток утечки – не более 15 пА;
- время нарастания сигнала – не более 100 мс при сопротивлении источника сигнала 20 мОм при отсутствии компенсации входной емкости;
- температурный дрейф должен быть меньше 50 мкВ. Остановимся подробнее на этих основных параметрах предварительного усилителя.
Входное сопротивление
Входное сопротивление предварительного усилителя должно превосходить сопротивление микроэлектрода не менее чем на 2-3 порядка. Следовательно, операционный усилитель, на базе которого выполняется предусилитель, должен иметь значительное входное сопротивление.
В современных радиоэлектронных элементах, на основе которых создают входные устройства, можно достичь входного сопротивления порядка 1012 Ом. Такая величина входного сопротивления достаточна для работы с микроэлектродами, предназначенными для внутриклеточного отведения биопотенциалов.
Коэффициент усиления
Коэффициент усиления большинства предварительных усилителей равен 1. Вместе с тем коэффициент предварительного усилителя может лежать в диапазоне от 0,95 до 2 и более.
Цепь компенсации входной емкости
Во всех современных предварительных усилителях предусмотрена цепь компенсации входной емкости. Для этого измерительную цепь шунтируют на землю с помощью конденсатора. Емкость этого конденсатора компенсирует предварительный усилитель. Сигнал подается на усилитель через входную емкость двух последовательно включенных сопротивлений по 10 МОм каждое, шунтированных на землю конденсатором емкостью 10 пФ. В этом случае время нарастания прямоугольного сигнала составляет приблизительно 440 мкс. Затем включением цепи отрицательной емкости необходимо добиться режима оптимальной компенсации, т.е. максимально быстрого фронта нарастания сигнала без осцилляций. Тогда для быстродействующего усилителя время нарастания сигнала не превышает 30 мкс.
Рабочий диапазон входных напряжений
Рабочий диапазон входных напряжений – область входных напряжений, которые без искажений передаются на вход усилителя. Для предварительных усилителей, используемых только для внутриклеточного отведения биопотенциалов, достаточным является рабочий диапазон входных напряжений не менее ±150 мВ. Для предварительных усилителей, которые применяют в электронно-измерительных цепях, позволяющих осуществлять искусственную внутриклеточную поляризацию мембран, рабочий диапазон входных напряжений должен быть достаточно широким, чтобы обеспечивать передачу напряжения смещения. Для таких усилителей необходимая величина диапазона входных напряжений – от ±1 В и выше.
Смещение постоянной составляющей
Регулировка напряжения смещения постоянной составляющей должна отвечать двум требованиям. С одной стороны, диапазон регулировки должен быть достаточно широким и достигать как минимум 200 мВ, с другой – необходима плавность регулировки, так как важно обеспечить установку напряжения смещения с точностью до 1 мВ. Для выполнения этого требования необходимо использовать два переменных сопротивления для грубой и плавной регулировки.
Ток утечки
Ток утечки – ток, который протекает через входную цепь усилителя при отсутствии внешнего сигнала. Ток утечки может иметь любое направление. Если ко входу усилителя подсоединен микроэлектрод, введенный в клетку, то ток утечки, протекая через клетку, поляризует ее мембрану. Именно поэтому он должен быть крайне мал. Создаваемое током падение напряжения на сопротивление микроэлектрода не должно превышать 1 мВ. Показано, что для сопротивления микроэлектрода величиной 100 МОм ток утечки должен быть не более 10-11 А.
Величина тока утечки поддается измерению. Для этого необходимо заземлить вход предварительного усилителя и измерить амплитуду напряжения на выходе. Затем необходимо заземлить вход предварительного усилителя через сопротивление известной величины порядка 100 МОм и снова замерить амплитуду выходного напряжения, после чего можно рассчитать амплитуду тока утечки по отношению:
ΔЕ / ( А х R ), (1.3)
где ΔЕ – разность между двумя измеренными значениями выходного напряжения; А – коэффициент усиления; R – коэффициент сопротивления известной величины.
Полоса пропускания
Необходимая полоса пропускания частот для предварительного усилителя лежит в диапазоне от 0 до 100 кГц. Из литературы известно, что основной фактор, ограничивающий полосу пропускания в области верхних частот, это постоянная времени входной цепи предварительного усилителя:
τ = Rмэ х С, (1.4)
где Rмэ – сопротивление микроэлектрода, С – емкость входной цепи, причем
С = Смэ + Свх (1.5)
где Свх – входная емкость предварительного усилителя, а Смэ – емкость микроэлектрода.
Показано, что С может достигать 10-20 пФ, а при Rмэ >107 Ом нельзя получить полосу пропускания шире 0-1 кГц.
Время нарастания
Наибольший интерес представляют не частотные, а временные характеристики устройств. Наиболее эффективный параметр – время нарастания tн.
Время нарастания представляет собой время, за которое сигнал на выходе нарастает от 10 до 90%. Для передачи сигналов без искажений необходимо, чтобы tн составляло менее 1/5 от времени нарастания входного сигнала до его пикового значения.
Частота среза
Частота среза (fср) – частота, при которой амплитуда синусоидального сигнала на
1 / √ 2 = 0,7
выходе усилителя падает до амплитуды того же сигнала на низких частотах. Необходимо, чтобы fср и tн были связаны соотношением:
fср х tн = 0,35
где tн измеряется в мс, а fср – в кГц.
Из числа наиболее доступных отечественных микросхем наиболее предпочтительна К544УД1А, представляющая собой дифференциальный операционный усилитель с высоким входным сопротивлением. Принципиальная схема неинвертирующего усилителя с масштабным коэффициентом передачи на базе микросхемы К544УД1А приведена на рис. 1.
Измерительная схема
Измерительная схема для микроэлектродных исследований клеток включает в себя несколько блоков. К ним относятся: блок калибровки сигналов, блок регулировки постоянной составляющей потенциала, блок определения нуля, блок измерения сопротивления микроэлектрода, блок усиления сигналов.
Блок калибровки сигналов
В наиболее простом виде этот блок служит для калибровки потенциала. И хотя во всех осциллографах предусмотрены внутренние калибраторы, в электронно-измерительной схеме для регистрации биоэлектрических параметров клеток эти калибраторы можно использовать только в случае, если коэффициент усиления строго равен 1. Поскольку такой точности коэффициента усиления добиться затруднительно, необходимо проводить сравнение регистрируемого биопотенциала, прошедшего через усилитель, и стандартного сигнала, также прошедшего через усилитель. Для этого собирают схему, представленную на рис. 2.
Между индифферентным электродом и землей включают сопротивление R1=100 Ом, на котором можно создать падение напряжения, соизмеримое с биопотенциалом. Поскольку в ряде случаев необходимы разные значения калибровочных сигналов, предусмотрены резисторы R2 и R3. В качестве источника питания (2 на рис. 2) используют батарейку типа «Крона» или «Корунд». В связи с применением батарейки предусмотрено наличие цифрового вольтметра (1 на рис. 2) типа В7-35. Для подключения резисторов R2 и R3 имеются реле (например, типа РЭС-80) Р2 и Р3, а для подключения вольтметра – реле Р1. Включение и выключение реле Р1, Р2 и Р3 осуществляют с пульта управления микротумблерами и микрокнопками.
Что же касается измерения длительности изучаемых сигналов, то их можно проводить, основываясь на значениях временных шкал электронных осциллографов или метчиков времени шлейфных осциллографов. Эти приборы должны проходить регулярную настройку, которую можно осуществлять, используя кварцевые генераторы.
Блок регулировки постоянной составляющей потенциала
Блок регулировки постоянной составляющей потенциала или, иначе говоря, блок регулировки нуля, вводят в каждую электронно-измерительную схему для регистрации биоэлектрических параметров клеток. В целом задача аналогичного плана – регулировка нуля – решается в усилителе. В каждой из используемых для усилителей биопотенциалов микросхем предусмотрена возможность смещения нуля, и эту регулировку производят перед эксплуатацией усилителя.
Введение в электронно-измерительную схему для регистрации биоэлектрических параметров клеток специального блока регулировки постоянной составляющей потенциала связано с необходимостью скомпенсировать постоянное смещение потенциала, вызванное собственными потенциалами микроэлектродов и потенциалами, возникающими при переходах «физиологический раствор → электролит микроэлектрода → хлорсеребряный проводник». Этот источник электрохимической асимметрии значительно смещает потенциал. Подробно причины, вызывающие смещение нулевой линии, изложены в соответствующем разделе. В настоящем разделе мы остановимся на схеме регулировки постоянной составляющей потенциала, которая представлена на рис. 3.
Между индифферентным электродом и блоком калибровки сигналов включают два переменных резистора, причем один из них – R1 – служит для грубой регулировки нуля, второй – R2 – для плавной регулировки нуля. В качестве источника питания используют батарейку. Для подключения блока служит реле Р1. Включение и выключение реле Р1осуществляется микротумблером. Поскольку постоянное смещение потенциала, вызванное источниками электрохимической асимметрии, может происходить и в области положительных значений, и в области отрицательных значений, предусматривается переключатель П1, меняющий полярность. Компенсацию постоянной составляющей потенциала проводят перед введением микроэлектрода в клетку, когда он опущен в физиологический раствор. Подстройкой R1 и R2сводят постоянное смещение потенциала к нулю.
Блок определения нуля
В процессе работы с электронно-измерительной схемой для регистрации биоэлектрических параметров клеток необходимо систематически фиксировать измерительный нуль. Для этого на неинвертирующем и инвертирующем входе операционного усилителя необходимо предусмотреть два реле, как это показано на рис. 4.
Включение реле Р1 и Р2 замыкает неинвертирующий и инвертирующий входы усилителя и подключает их к земле. Уровень потенциала, регистрируемого в этом случае сбалансированным осциллографом и сбалансированным операционным усилителем, соответствует измерительному нулю.
Блок измерения сопротивления микроэлектрода
Сопротивление микроэлектрода не является постоянной величиной. В процессе эксперимента по многим причинам оно может меняться как в сторону уменьшения, так и в сторону увеличения, поэтому в электронно-измерительной схеме для регистрации биоэлектрических параметров клеток обычно предусмотрен блок измерения сопротивления микроэлектрода. Это позволяет не только измерять сопротивление микроэлектрода перед экспериментом, но и контролировать его в процессе работы.
Существует несколько конструктивных вариантов блока измерения сопротивления микроэлектрода. Наиболее простая и употребляемая схема представлена на рис. 5.
В этом случае используют делитель напряжения. Параллельно микроэлектроду при помощи реле Р1, Р2 или Р3 подключают поочередно резисторы R1, R2 или R3 известной величины. При этом до и после подключения каждого резистора подают калибровочный сигнал. Сопротивление микроэлектрода оценивают по уменьшению сигнала калибровки при подключении известного шунтирующего резистора. Например, если при подключении резистора 40 МОм калибровочный сигнал падает в 2 раза, то сопротивление микроэлектрода равно 40 МОм. Весь блок измерения сопротивления микроэлектрода подключают при помощи реле Р4, которое целесообразно располагать вблизи входа усилителя.
Заземление системы для микроэлектродных исследований клеток
При работе с системами измерения очень важно организовать правильное заземление аппаратуры.
Во-первых, назначение заземления состоит в обеспечении защиты от опасного для жизни поражения электрическим током. Во-вторых, назначением заземления является обеспечение стабильного потенциала сравнения для электронно-измерительной аппаратуры. В-третьих, заземление необходимо при экранировании системы от помех.
Систему заземления обеспечивает металлическая шина, которая связана с металлической базой в земле. Однако организация системы заземления должна осуществляться специалистами, поскольку неправильное с инженерной точки зрения заземление небезопасно. Целесообразно просто подвести земляную шину электросети к клеммам аппаратуры и приписать корпусу, например, осциллографа потенциал, равный 0 В. Непринципиально, действительно ли потенциал шины равен 0 В по отношению к идеальной земле. Вся система заземления может находиться и под ненулевым потенциалом. Однако необходимо, чтобы для всех элементов электронноизмерительной аппаратуры этот потенциал был одинаковым. В этом случае его можно рассматривать, как нулевой или опорный потенциал.
Необходимо разделить заземление на корпусное и сигнальное. Корпусная земля служит для заземления корпусов приборов с сетевым питанием и обеспечивает, с одной стороны, защиту от поражения электрическим током и, с другой стороны, экранирует от сетевых помех. Сигнальная земля служит для обеспечения опорного потенциала в электронно-измерительной аппаратуре. Во избежание образования замкнутых контуров из проводов заземления сигнальная и корпусная земля должны соединяться только в одной точке. Этой точкой обычно служит корпус осциллографа.
Металлические стенки такой камеры экранируют с пяти сторон попадания помех на измерительные цепи. Шестую сторону можно делать закрывающейся. В качестве экранирующей камеры обычно используют стандартную камеру, входящую в состав комплекта микроманипуляторов КМ-2. При ее отсутствии можно сделать короб из любого металла размером 1,5×1,5×1,5 м (как из цельного листа, так и из металлической сетки), причем его стенки должны быть электрически связаны (сваркой или болтами). Применение полностью экранированной экспериментальной комнаты, так называемой камеры Фарадея, не оправданно.
С помехами, обусловленными переменными магнитными полями, создаваемыми, например, трансформаторами и электрическими двигателями, бороться крайне трудно. Эти типы оборудования лучше не размещать вблизи измерительной установки. Осветители в микроскопах, понижающие осветительные трансформаторы и их соединительные провода создают как магнитные, так и электрические помехи. Использование ламп со стабилизированным питанием снижает помехи. При установке осветителей целесообразно вынести стабилизированный источник питания за пределы экранирующей камеры, заэкранировать соединительные провода оплеткой, а узел освещения, включающий лампу в корпусе, обернуть металлической сеткой, которую также необходимо заземлить.
Электронно-измерительная схема для стимуляции клеток
При помощи микроэлектродов можно не только регистрировать внутриклеточные потенциалы, но и производить искусственное смещение мембранного потенциала в виде гиперполяризации или деполяризации. Это искусственное смещение мембранного потенциала дает возможность возбуждать или тормозить электрическую активность клеток. Такое смещение мембранного потенциала дает возможность не только изучать пассивные электрические характеристики клеток, но и исследовать межклеточное взаимодействие, осуществляемое, например, непосредственно через высокопроницаемые контакты мембран клеток. Однако возможность внутриклеточной поляризации мембран должна непременно сочетаться с возможностью одновременной регистрации биоэлектрической активности клеток и тех изменений этой активности, которые возникают вследствие приложения электрического тока.
В наиболее примитивном варианте принцип внутриклеточной поляризации мембран при возможности одновременной регистрации биоэлектрической активности клеток представлен на рис. 6.
В этом случае в клетку вводят одновременно два микроэлектрода, один из которых является поляризующим, а другой – регистрирующим (рис. 6, а). На экране двухлучевого осциллографа будет виден процесс, проиллюстрированный на рис. 6, б, когда по верхнему первому каналу регистрируется величина поляризующего сигнала, а по нижнему второму каналу – мембранный потенциал и его искусственное смещение, вызванное поляризацией мембраны. Следует помнить, что прямое подключение поляризующего микроэлектрода к генератору невозможно.
Вместе с тем даже при технически грамотном подходе использование двух микроэлектродов для введения в одну клетку – задача весьма сложная, даже если работа выполняется на гигантских нейронах беспозвоночных. Если же необходимо изучать межклеточное, например, электротоническое взаимодействие двух нейронов, то в препарат необходимо ввести четыре микроэлектрода (по два в каждую клетку), что практически невыполнимо. При изучении мелких клеток нервной системы или кардиомиоцитов ввести два микроэлектрода в одну клетку просто невозможно. В этом случае необходимо, чтобы один и тот же микроэлектрод выполнял роль и регистрирующего. и поляризующего.
Основная проблема, возникающая при попытке одновременного измерения биопотенциалов клетки и поляризации ее мембраны при помощи только одного микроэлектрода, заключается в следующем. Как показано на рис. 7, от источника тока к клетке через микроэлектрод, имеющий сопротивление Rмэ обладающей емкостью См и сопротивлением Rм, подводят ток I. В этом случае регистрируемый усилителем потенциал состоит из двух компонент: падения напряжения на микроэлектроде (E1=IxRмэ) и изменения мембранного потенциала клетки Е2, вызванного стимуляцией током. Поскольку величина Е1 не несет информации о состоянии клетки, ее необходимо исключать из сигнала на входе предварительного усилителя. Это осуществляют путем электронного вычитания или прямой компенсации.
Реальная схема подключения источника напряжения через последовательное сопротивление представлена на рис. 8. Сопротивление R должно быть достаточно высоко для того, чтобы предотвратить утечку тока из клетки в промежутках между импульсами стимуляции, поэтому оно должно в 20-50 раз превышать входное сопротивление клетки.
Сопротивление R должно быть достаточно высоко и для того, чтобы при подаче импульса стимуляции ток не зависел от сопротивления микроэлектрода. Для этого оно должно в 20-50 раз превышать сопротивление микроэлектрода.
Обычно требуемая величина R лежит в диапазоне от 109 до 1010 Ом. Такие резисторы достаточно редки. Кроме того, они требуют специального обращения, так как любое повреждение центрального цветного кольца, пыль или отпечатки пальцев на поверхности и другое существенно уменьшают величину сопротивления.
Вместе с тем эта схема является наиболее практичной, поскольку не требует предварительной настройки и подстройки в процессе эксперимента. Кроме того, при использовании такой схемы со стимулятора можно подавать импульсы любой длительности. В случае необходимости подавать со стимулятора импульсы тока с быстрыми фронтами нарастания резистор R необходимо подключить в непосредственной близости к микроэлектроду для сведения к минимуму влияния «паразитной» емкости.
При применении данной схемы величина тока стимуляции I равна:
I = E / ( R + Rмэ + Rм ),
где Rм – входное сопротивление мембраны.
Если применяемое R велико, то для получения тока в несколько наноампер необходимо подавать значительное напряжение.