Стеклянный микроэлектрод – это стеклянная микропипетка, форма которой представлена на рис. 1. Такая микропипетка состоит из цилиндрической, сужающейся и колющей части (1, 2, 3 на рис. 1.1). В центре микропипетки имеется сквозной продольный канал (4 на рис. 1), диаметр которого зависит от параметров стеклянной заготовки. Стеклянную микропипетку можно назвать микроэлектродом после заполнения ее сквозного продольного канала электролитом и образования контакта (тем или иным способом) электролита с электронно-измерительной схемой.
Микроэлектроды, их изготовление и основные характеристики
В качестве заготовок применяют трубки из различных сортов стекла. Обычно используют боросалицилатные марки стекла «Пирекс», «Феникс», «Кимакс». Эти виды стекла содержат кварц с добавкой оксида бора (В2О3) и мало щелочных окисей. Они отличаются химической стабильностью, невысокой температурой размягчения (до 800 °С), высокой диэлектрической постоянной, малым коэффициентом теплового расширения, низкой растворимостью в воде. В ряде случаев возможно применение алюмосиликатного стекла 48-ЗС и чистого кварца, но работать с этими заготовками трудно из-за высокой температуры их размягчения (до 1500 °С). Обычно пользуются заготовками из стекла марки «Пирекс», которые выполнены в виде цилиндров с внешним диаметром 10 мм и внутренним диаметром 8 мм. Однако эти заготовки требуют высококачественной очистки внутренней и внешней поверхности стекла. Очистка заготовок сводится к следующему. С помощью ватного тампона, смоченного раствором детергента (в наиболее простом случае – стирального порошка «Лотос») и надетого на шомпол, очищают внутреннюю, а затем внешнюю поверхность цилиндрической заготовки. Затем заготовку с помощью резинового шланга подсоединяют к водопроводу и промывают в течение 50-60 мин холодной водой. Отмывают также и внешнюю поверхность заготовки. Затем заготовку внутри и снаружи промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе при комнатной температуре. Сухую заготовку помещают на 15-20 мин в стеклянный цилиндр, заполненный концентрированной соляной кислотой. После извлечения из кислоты заготовку вновь подсоединяют к водопроводу и осуществляют промывание ее внутренней и внешней поверхности холодной водой в течение 30-40 мин с последующим ополаскиванием в дистиллированной воде и высушиванием.
Далее из стеклянной заготовки вытягивают капилляры. Для изготовления стеклянных микроэлектродов используют такие приборы, как пуллеры и микрокузницы. В России для этого существует прибор для вытяжки капилляров ПВК-1. Он предназначен для изготовления капилляров, которые используют в дальнейшем для изготовления микроэлектродов и стеклянных микроинструментов. Работа прибора основана на свойствах стекла размягчаться под действием температуры и переносить при вытягивании соотношение внешнего и внутреннего размеров заготовки на капилляр. Прибор обеспечивает вытяжку стеклянных капилляров или стержней диаметром от 0,4 до 4 мм из заготовок диаметром от 6 до 20 мм и длиной 1 м при температуре размягчения до 800 °С. Прибор выполнен по схеме с вертикальным вытягиванием капилляра, что обеспечивает высокую точность его геометрических размеров.
Для изготовления микроэлектродов лучше использовать стеклянные капилляры одинакового диаметра. И хотя прибор для вытяжки капилляров типа ПВК-1 позволяет получать капилляры одинакового диаметра, работая в каком-либо определенном режиме, тем не менее целесообразно выборочно замерять диаметр полученных изделий микрометром.
Для получения стеклянных микроэлектродов с наружным диаметром колющей части менее 0,1 мкм из капилляров диаметром 1-6 мм обычно применяют пуллеры типа МЭ-4. Общий вид прибора МЭ-4 представлен на рис. 2. В верхней части прибора размещены два зажима: верхний (10 на рис. 2), неподвижный, и нижний (14 на рис. 2), подвижный, соединенный с сердечником электромагнита. Между зажимами находится колонка спирали (12 на рис. 2), в которую устанавливается спираль (11 на рис. 2) нагрева стеклянного капилляра, выполненная из 3-5 витков нихромовой проволоки диаметром 0,5-1 мм. На лицевой панели прибора размещены ручки управления и настройки. Для устранения возможного обдува места нагрева капилляра передняя часть прибора закрыта прозрачным кожухом.
Напряжение на спирали устанавливается переключателем грубой регулировки (15 на рис. 2), оно составляет 0-6 В и 0-12 В и плавно регулируется в каждом диапазоне регулятором (16 на рис. 2). Усилия разрыва достигают плавным перемещением регулятора (3 на рис 2). Длина сужающейся части микроэлектрода зависит от момента срабатывания электромагнита и определяется положением регулятора (5 на рис. 2). Прибор включается в сеть кнопкой (2 на рис 2). Сетевой индикатор (4 на рис. 2) служит для контроля за включением прибора. После включения прибора стеклянный капилляр пропускают через отверстие спирали (11 на рис. 2) и закрепляют в верхнем зажиме винтом верхнего зажима (8 на рис. 2). Нижний зажим вручную поднимают до упора, в нем при помощи винта нижнего зажима (6 на рис. 2) закрепляют нижний конец капилляра. После нажатия кнопки (1 на рис. 2) электрический ток подается на спираль и соленоид, что служит началом процесса изготовления микроэлектрода. При нагревании по мере размягчения стекла капилляр под действием веса нижнего зажима и за счет усилия, создаваемого индукционным полем соленоида в сердечнике, связанном с нижним зажимом, начинает удлиняться и утоньшаться, создавая сужающуюся часть микроэлектрода. В момент, определяемый положением регулятора (5 на рис. 2), замыкаются внутренние контакты, что приводит к быстрому возрастанию тока в цепи соленоида, вследствие чего резко втягивается сердечник, и происходит разрыв стеклянной трубки в зоне размягчения. Одновременно отключается спираль. Рывок сердечника обеспечивает формирование колющей части микроэлектрода.
Геометрические параметры микроэлектрода при этом зависят от сорта стекла, диаметра капилляра, диаметра и количества витков спирали, напряжения на спирали, силы рывка сердечника, момента начала рывка. Регулируя эти параметры, можно получить микроэлектроды необходимой геометрической конфигурации.
Изготовленные микроэлектроды могут иметь разную геометрическую конфигурацию, некоторые примеры которой представлены на рис. 1. и 3. Геометрическая конфигурация микроэлектродов зависит от параметров МЭ-4, типа стекла, диаметра капилляра и площади нагревательного элемента. Обычно изготавливают микроэлектроды, цилиндрическая часть которых имеет длину от 10 до 60 мм и диаметр 1 мм. Цилиндрическая часть должна плавно переходить в сужающуюся, которая заканчивается колющей частью с диаметром в пределах 0,5 мкм (см. рис. 1). Если колющая часть микроэлектрода при оптической микроскопии теряется в интерференционной кайме, то ее диаметр – менее 0,5 мкм. На рис. 3 представлена геометрическая конфигурация микроэлектродов, которые обычно не применяют.
Заполнение микроэлектрода
Механизм заполнения микроэлектродов электролитом основан на том, что водный раствор лучше взаимодействует со стеклом, чем с воздухом, что иллюстрируется явлением самозаполнения капилляра. Вместе с тем заполнение микроэлектродов, основанное на этом принципе, может происходить только в том случае, если размеры колющей части на 1-2 порядка превышают величину 0,5 мкм. Это связано с вязкостью жидкости.
Применительно к микроэлектроду необходимо, чтобы при его заполнении значительные объемы жидкости вошли через колющую часть или – иначе – значительные объемы воздуха вышли через колющую часть. При внешнем диаметре колющей части, лежащем в пределах 0,5 мкм, это крайне трудно. Однако подавляющее большинство способов заполнения микроэлектродов основано на этом принципе. Все они тем не менее являются неудовлетворительными, поскольку заполнение микроэлектродов требует длительного времени и применения сложной технологии, при этом выход качественной продукции весьма низкий.
Вместе с тем еще в 1968 г. Тасаки предложил блестящий способ заполнения микроэлектродов, который удивительно прост в использовании, причем заполнение микроэлектрода происходит в считанные секунды.
Речь идет о применении микроэлектродов, у которых внутренний сквозной канал содержит стекловолокно, иначе говоря, по всей длине микроэлектрода к его внутренней поверхности приварены 4-6 стеклянных волокон.
По обе стороны от стекловолокна, расположенного в сквозном продольном канале, в месте его спайки с внутренней стенкой микроэлектрода возникает гидравлический «трубопровод» (рис. 4, а), вдоль которого под действием капиллярных сил продвигается заполняющий раствор. Основной объем сквозного цилиндрического канала микроэлектрода при заполнении занимает воздух, который перемещается одновременно с электролитом, но в противоположном направлении. При попадании раствора в цилиндрическую часть микроэлектрода в его сквозном продольном канале образуются пузырьки воздуха, которые постепенно самопроизвольно выходят. Это связано с тем, что радиусы кривизны двух менисков на границе раствор-воздух различны, благодаря чему возникает необходимый градиент давления (рис. 4, б). При этом стекловолокно облегчает прохождение заполняющего раствора к колющей части микроэлектрода на место, освобожденное пузырьком воздуха.
Этот способ отличается быстротой заполнения (до 1 мин). Заполнение микроэлектродов электролитом происходит при комнатной температуре. На заполнении не сказывается относительная загрязненность электролита. Способ, по мнению многих исследователей, не имеет никаких недостатков. Для его реализации применяют модифицированный метод вытягивания капилляров. Из тщательно очищенной стеклянной заготовки при помощи прибора для вытяжки капилляров изготавливают несколько стеклянных капилляров, у каждого из которых в пламени горелки загибают одну сторону.
Затем в подготовленную стеклянную заготовку вводят 4-6 капилляров, которые зацепляют за стенки заготовки местом изгиба и располагают симметрично по окружности заготовки (рис. 5). Подготовленная таким образом заготовка помещается в рабочую часть прибора для вытяжки капилляров, и уже из нее вытягивают капилляры со стекловолокном.
В процессе изготовления происходит не только вытяжка капилляров, но и сплавление стекловолокна с внутренней поверхностью капилляра. Затем из капилляров со стекловолокном при помощи прибора для изготовления микроэлектродов производят микроэлектроды со стекловолокном. У полученного микроэлектрода алмазным резцом надсекают по окружности цилиндрическую часть, как это показано на рис. 6, а, и обламывают для создания ровной поверхности скола. Подготовленный таким образом микроэлектрод вводят цилиндрической частью в отверстие пробки пенициллинового пузырька микроэлектродом вниз и оставляют на 1 мин для заполнения (рис. 6, б). При этом наблюдается интенсивный выход воздуха в виде пузырьков из цилиндрической части сквозного продольного канала микроэлектрода. Заполненный электролитом микроэлектрод помещают в ванночку с электролитом и под микроскопом контролируют качество его заполнения. Если в сквозном продольном канале микроэлектрода нет пузырьков воздуха, его можно использовать в работе.
В ряде случаев в шейке сужающейся части заполненного электролитом микроэлектрода может остаться видимый глазом пузырек воздуха. Он удаляется при помощи легкого встряхивания микроэлектрода. Заполненные микроэлектроды крепятся на предметном стекле между двумя кольцами из мягкой резины (рис. 7, а). Само предметное стекло опускают в стаканчик с электролитом, который закрывают пробкой (рис. 7, б). В таком виде микроэлектроды могут храниться в течение суток в холодильнике. При более длительном хранении в сквозном продольном канале наблюдается кристаллизация электролита, что значительно повышает электрическое сопротивление микроэлектрода.
Для заполнения микроэлектродов используют хорошо диссоциирующие электролиты, прежде всего раствор хлорида калия (КСl). Это связано с тем, что ионы К+ и Сl–несут одинаковый по величине заряд и имеют близкие коэффициенты диффузии, поэтому при движении КСl по градиенту концентрации из микроэлектрода происходит незначительное разделение зарядов. Обычно используют 3 М раствор КСl. Однако он быстро кристаллизуется в сквозном продольном канале микроэлектрода. Микроэлектроды, заполненные 3 М раствором КСl, практически не хранятся, их заполняют непосредственно перед экспериментом. Это не всегда удобно, в связи с чем авторы используют 2,5 М раствор электролита.
Можно использовать любой электролит в эквивалентных концентрациях, однако ионы других растворов, диффундируя из микроэлектрода, могут оказывать влияние на биоэлектрическую активность изучаемых клеток, что относится и к раствору КСl. Если утечка ионов К+ не сказывается на функционировании мембран клеток, то утечка ионов Сl– приводит к существенным изменениям равновесного потенциала по хлору.
В качестве одного из индифферентных электролитов рекомендуют 2 М раствор цитрата калия. Можно применить и раствор ацетата калия в аналогичной концентрации. Такие растворы обычно используют при исследованиях тормозных постсинаптических потенциалов, механизм генерации которых определяется ионами Сl–.
Фильтрование раствора электролита, по мнению авторов, целесообразно проводить только в случае его видимого загрязнения или при использовании заведомо загрязненного вещества.
Относительно длительное (более суток) хранение незаполненных электролитом микроэлектродов нецелесообразно, так как измерение их сопротивления после последующего заполнения показало его значительное завышение. По-видимому, это происходит вследствие запыления колющей части. Однако если все же приходится хранить или транспортировать незаполненные электролитом микроэлектроды, то, по общему заключению, это лучше делать в полугерметичных коробочках.
Заполненные микроэлектроды лучше хранить не более суток в холодильнике при температуре в пределах +4 °С зафиксированными на предметном стекле при помощи двух резиновых колец, как это показано на рис. 7.
Заполненные микроэлектроды обладают определенными физико-химическими и электрическими свойствами. Поскольку электролиты, заполняющие микроэлектроды, высококонцентрированны, то определенное количество вещества будет выделяться в перфузионную среду или внутрь клетки путем диффузии. Можно считать, что диффузия электролита происходит при постоянных равновесных условиях с фиксированной концентрацией вещества в цилиндрической и сужающейся части и с нулевой концентрацией в области колющей части микроэлектрода. Расчеты показывают, что выход электролита из микроэлектрода вследствие диффузии прямо пропорционален внутреннему радиусу колющей части микроэлектрода и концентрации раствора. На самопроизвольном выделении вещества из микро-электрода сказывается и гидростатическое давление. Скорость выхода электролита из вертикально расположенного микроэлектрода обусловлена разницей в гидростатическом давлении между двумя концами микроэлектрода, причем выход жидкости из микроэлектрода, обусловленный гидростатическим давлением, растет с увеличением внутреннего радиуса колющей части. Если к раствору электролита в микроэлектроде приложить электрический потенциал, что происходит в процессе искусственной поляризации клеток, то ионы будут двигаться под действием электрического поля. Это явление носит название ионофореза. Наконец, при контакте раствора электролита со стеклом микроэлектрода между внутренней поверхностью стекла и раствором возникает двойной заряженный слой, который создает дзета-потенциал (ζ) или, иначе, электрокинетический потенциал. При применении сортов стекла, из которого обычно изготавливают микроэлектроды, возникает двойной слой, при котором раствор приобретает положительный заряд по отношению к стеклу.
Благодаря этому явлению при прикладывании потенциала к раствору электролита в микроэлектроде наблюдается движение жидкости и выделение из колющей части некоторых ее объемов. Это явление называется электроосмос. При электроосмосе все заряженные и незаряженные молекулы перемещаются в одном направлении с раствором.
Характеристики микроэлектродов
При работе с микроэлектродами необходимо контролировать 3 электрических свойства: электрическое сопротивление, емкость и потенциал микроэлектрода, описанию которых посвящен настоящий параграф.
Электрическое сопротивление микроэлектрода (R) – очень важный параметр, который контролируют перед экспериментом, а в ряде случаев – и в процессе работы. Это связано с тем, что, во-первых, электрическое сопротивление микроэлектрода является качественным показателем диаметра колющей части микроэлектрода. Установлено, что при одинаковых условиях более высокое электрическое сопротивление микроэлектрода свидетельствует о меньшем диаметре колющей части и, наоборот, более низкое электрическое сопротивление микроэлектрода свидетельствует о большем диаметре колющей части. Под одинаковыми условиями в данном случае подразумевают сорт стекла, толщину стеклянной стенки, диаметр капилляра, угол конуса колющей части, проводимость электролита и внешнего солевого раствора. Полагают, что электрическое сопротивление микро-электрода, величина которого лежит в диапазоне от 5 до 20 МОм, свидетельствует о высоком качестве колющей части. Если электрическое сопротивление микроэлектрода лежит в пределах 1 МОм и менее, то считают, что произошел облом колющей части, а если электрическое сопротивление больше 60 МОм, то колющая часть либо слишком тонка, либо забита кристаллами электролита или фрагментами биологической ткани. Во-вторых, необходимость контроля величины электрического сопротивления связана с тем, что высокоомные микроэлектроды характеризуются большим и нестабильным потенциалом колющей части, плохо пропускают токи, имеют большие шумы и чувствительны к внешним источникам электрических помех.
При микроэлектродных исследованиях биологических объектов обычно приходится сталкиваться с неким суммарным представлением о емкости (С), которая шунтирует входную цепь (рис. 8). Это, во-первых, входная емкость усилителя Сус, во-вторых, емкость цилиндрической и сужающейся части ствола микроэлектрода и соединительного проводника или паразитная емкость, Сп, и, наконец, это емкость колющей части микроэлектрода, распределенной с емкостью физиологического раствора или ткани, Ср. При этом емкости Сус и Сп обусловлены связью с землей, а емкость Ср – связью с внешней (для поверхности колющей части микроэлектрода) средой.
Суммируясь, емкость системы увеличивает постоянную времени входа усилителя (τвх=Rвх х Cвх) и искажает форму и амплитуду высокочастотных сигналов. Входная емкость усилителя Сус компенсируется в усилителях введением во входной каскад емкостной отрицательной обратной связи. Емкость Сп можно, во-первых, уменьшить, увеличив диаметр цилиндрической части микроэлектрода, уменьшив длину микроэлектрода и предельно уменьшив длину проводника, связывающего хлорсеребряный переходник со входом усилителя. Во-вторых, суммарная емкость системы считается скомпенсированной, если крутизна переднего фронта сигнала, снимаемого с выхода электронно-измерительной схемы при условии введения микроэлектрода в физиологический раствор, максимально приближается к переднему фронту прямоугольного сигнала, подаваемого на вход микроэлектрода от внешнего генератора прямоугольных сигналов (рис. 9).
Потенциал микроэлектрода, подключенного к электронноизмерительной схеме и введенного в физиологический раствор, никогда не равен нулю, т.е. регистрируется некая разность потенциалов, которая называется потенциалом смещения. Потенциал смещения обусловлен тремя составляющими.
Первая составляющая – диффузионный потенциал, возникающий между раствором внутри микроэлектрода и электролитом вокруг его колющей части, введенной в физиологический раствор. Диффузионный потенциал мал, так как в качестве электролита для заполнения микроэлектродов обычно используют КСl, причем ионы К+ и Сl– имеют близкие коэффициенты диффузии и несут одинаковый по величине заряд. Именно поэтому при движении КСl по градиенту концентрации происходит незначительное разделение зарядов и возникающий при этом диффузионный потенциал невелик.
Вторая составляющая – потенциал, возникающий между хлорсеребряным проводником микроэлектрода и хлорсеребряным проводником индифферентного электрода.
При подаче на микроэлектрод напряжения в диапазоне 1-10 В происходит закипание электролита в колющей части вследствие высокой плотности тока. Это приводит к регистрации хаотичных колебаний тока, связанных с временными блокадами колющей части.
При подаче на микроэлектрод более низких напряжений воспроизводятся нелинейные вольт-амперные характеристики . В литературе для микроэлектродов описана нелинейность двух типов. Нелинейность первого рода (рис. 10, а, б) заключается в том, что сопротивление микроэлектрода для выходящего тока больше, чем для входящего. При этом существует предельное значение выходящего тока, которое невозможно превысить, подав сколь угодно высокое напряжение. Нелинейность второго рода (рис. 11, а, б) проявляется в обратной вольт-амперной характеристике. Выходящий ток вызывает падение сопротивления.
Микроэлектроды с длинными сужающимися частями очень гибкие. Их удается использовать для регистрации внутриклеточной биоэлектрической активности клеток, способных к сокращению даже при креплении в жестком держателе. Однако длинная сужающаяся часть вибрирует в процессе эксперимента. Кроме того, при прокалывании соединительнотканных оболочек электрод может изгибаться, и сделать прокол не получается.
Микроэлектроды с короткими сужающимися частями не являются гибкими и практически не подвержены вибрации. Их удобно применять при прокалывании клетки, окруженной соединительнотканной оболочкой.
В целом микроэлектроды достаточно прочны на излом благодаря тому, что при их вытягивании сглаживаются трещины Гриффита, т.е. микроскопические дефекты стекла в виде царапин, имеющиеся на заготовках.
Что же касается прочности самой колющей части, то, несмотря на возможную оценку ее облома через измерение электрического сопротивления микроэлектрода, целесообразно один микроэлектрод использовать не более чем на 2-3 вкалывания.
Типы соединения микроэлектродов
Как уже было отмечено, стеклянная микропипетка становится микроэлектродом, когда она заполнена электролитом и тем или иным способом создан контакт между электролитом внутри микропипетки и электронно-измерительной схемой. Существует два наиболее часто применяемых принципа соединения электролита микропипетки с входом электронно-измерительной схемы, основанных на использовании двух конструктивно разных держателей микропипетки. Это принцип жесткой фиксации микроэлектрода и принцип свободного зависания микроэлектрода, или плавающего микроэлектрода.
Жесткую фиксацию микроэлектрода применяют для исследований внутриклеточных биоэлектрических параметров несократимых клеток, например нейронов. Микроэлектрод должен быть жестко закреплен на микроманипуляторе для обеспечения его точного подведения к выбранной клетке и прокола ее мембраны. Это обеспечивают с помощью специальных держателей микроэлектродов. Кроме того, у микроэлектрода должен быть контакт между заполняющим его электролитом и входом электронно-измерительной схемы, и это также является функцией держателя микроэлектрода. В наиболее простом виде держатель для жесткой фиксации микроэлектродов представлен на рис. 12.
Система микроэлектрод-держатель сообщается следующим образом. Полость (4 на рис. 12) корпуса (3 на рис. 12) держателя заполняют электролитом, причем обычно используют 2% агар-агар, сваренный на 2,5 М растворе КСl Затем посредством резьбы, нанесенной на внутренней поверхности полости корпуса и на внешней поверхности основания (1 на рис. 12), основание ввинчивают в полость, в результате чего излишек электролита удаляется через сквозное отверстие в прижимной гайке (6 на рис. 12). При сборке основания держателя и его корпуса прижимная гайка должна быть максимально вывернута для того, чтобы ослабить сдавливание кольцевого резинового уплотнителя (5 на рис. 12). После удаления излишка электролита в сквозное отверстие в прижимной гайке через кольцевой резиновый уплотнитель в полость корпуса держателя вводят микроэлектрод (7 на рис. 12) так, чтобы заполняющий его электролит контактировал с электролитом, находящимся в полости корпуса держателя. Жесткое крепление микроэлектрода обеспечивается путем ввинчивания гайки, которая прижимает кольцевой резиновый уплотнитель, плотно обхватывающий цилиндрическую часть микроэлектрода. Одновременно с этим кольцевой резиновый уплотнитель служит для предотвращения подтекания электролита из полости корпуса держателя или его высыхания.
Таким образом, устанавливают контакт электролита микроэлектрода-электролита корпуса держателя, серебряной проволоки основания держателя. Для соединения микроэлектрода с электронно-измерительной аппаратурой теперь достаточно соединить внешний вывод серебряной проволоки основания держателя через гибкий проводник со входом электронно-измерительной схемы. Место контакта серебряной проволоки и гибкого проводника должно тщательно предохраняться от попадания электролита агарового мостика.
Плавающие микроэлектроды, применяют для исследований внутриклеточных биоэлектрических параметров сократимых клеток возбудимых тканей – мышечных клеток (в большинстве случаев – кардиомиоцитов бьющегося сердца). Микроэлектрод в этом случае свободно завешивается над возбудимой подвижной тканью на тончайшей проволоке так, что один из ее концов соединен с электролитом микроэлектрода, а другой подсоединен ко входу измерительной аппаратуры. В наиболее простом виде держатель для плавающего микроэлектрода представлен на рис. 13 (выполнен на базе основания стандартного держателя).
Для изготовления модифицированного держателя из его основания (1 на рис. 13) извлекают серебряную проволоку, а в образовавшееся отверстие вводят проволочный проводник (3 на рис. 13) диаметром 20-30 мкм. При этом один из концов (7 на рис. 13) проволочного проводника подсоединяют ко входу электронноизмерительной схемы, а ко второму концу подваривают (или, если это невозможно, припаивают) хлорированную серебряную иглу (4 на рис. 13) длиной в пределах 3 мм. Эту иглу затем вводят в цилиндрическую или сужающуюся часть (6 на рис. 13) микроэлектрода (в случае применения различных конструкций микроэлектродов). Фиксация микроэлектрода на игле в этом случае осуществляется нитролаком (5 на рис. 13), как это показано на рис. 13. Не допускается введение хлорированной серебряной иглы в микроэлектрод так, чтобы электролит попадал на проволочный проводник или место сварки (пайки). Это место контакта лучше тоже покрывать нитролаком.
Серебряные иглы изготавливают путем электролитической заточки в 4% растворе азотной кислоты и затем приваривают торцом или к торцу проволочного проводника посредством вольтовой дуги либо припаивают.
Хлорирование проводника
Для того чтобы регистрируемый потенциал был стабилен и не изменялся во время эксперимента, в том числе при пропускании через измерительную схему слабых токов, а другими словами, чтобы нулевая линия, регистрируемая осциллографом при погруженном в физиологический раствор микроэлектроде, «не плыла», необходимо применять так называемые обратимые или неполяризующиеся переходы границы «электролит микроэлектрода (или держателя) – проволочный проводник входа электронно-измерительной схемы». Именно с этой целью на переходных границах и применяют серебряную проволоку или серебряные иглы, которые при этом подвергают хлорированию. На серебряной проволоке или игле, покрытой слоем хлорида серебра (AgCl), протекает обратимая реакция: Ag+ + Cl– = AgCl + e–
Слаборастворимая соль AgCl служит донором ионов Сl–, запасенных в твердой фазе.
Существует множество разработанных процедур хлорирования серебра: серебро помещают в 0,1 М раствор соляной кислоты (НСl) и через него пропускают электрический ток от батарейки в 1,5 В, причем полярность тока меняется 3-5 раз с интервалом 30 с. Следует отметить, что образующееся при этом хлорсеребряное покрытие серого или темно-серого цвета механически непрочно и разрушается при эксплуатации и под действием света.
Если после этого полученные хлорсеребряные проводники использовать как переходные проводники в случае микроэлектрода в качестве перехода электролит – проволочный проводник, а в случае индифферентного электрода – в качестве перехода физиологический раствор – проволочный проводник, то при включении электронно-измерительной схемы возникнет значительная разность потенциалов между рабочим и индифферентным электродом. В данном случае эта разность потенциалов будет обусловлена двумя причинами. Первая причина заключается в том, что после процедуры хлорирования хлорсеребряные проводники отличаются потенциалами. Это легко устранить, объединив после хлорирования все серебряные элементы, находящиеся в растворе НСl, и оставив их на 3-6 ч в темном месте для уравновешивания потенциала.
Вторая причина связана с тем, что хлорсеребряный проводник рабочего и индифферентного электрода контактирует с растворами, имеющими разную активность ионов Сl–. Хлорсеребряный проводник рабочего микроэлектрода погружен в 2,5 М раствор КСl, а хлорсеребряный проводник, выполняющий роль индифферентного электрода, погружен в физиологический раствор. В этих условиях два хлорсеребряных проводника образуют концентрационный гальванический элемент, создающий потенциал смещения, достигающий 100 мВ относительно нуля. Для предотвращения возникновения потенциала смещения необходимо, чтобы среда, в которой находятся хлорсеребряные проводники, имела одинаковую активность ионов Сl–. С этой целью индифферентный электрод выполняют в виде микропипетки с надломленным кончиком, заполненной 2,5 М раствором КСl, куда вводят хлорсеребряный проводник.
Однако разность потенциалов, связанную с процессами, происходящими на хлорсеребряных проводниках, легко скомпенсировать посредством электронно-измерительной схемы, о чем речь пойдет далее.