Качественная оценка фармакологического действия противосудорожных соединений по признакам ЭЭГ динамики (I итерация, пробно-подготовительная)

В работе изучены современные методологические возможности для дифференциальной оценки фармакологических свойств противосудорожных средств по данным электроэнцефалографии.

Введение

Цель: качественная оценка фармакологического действия соединений на основании ЭЭГ динамики.

Задачи:

  1. Изучить и оценить современные подходы к анализу ЭЭГ, выявить наиболее перспективные методы;
  2. Адаптировать и оптимизировать методологический процесс анализа ЭЭГ для задач экспериментальной
    фармакологии;
  3. Классифицировать ЭЭГ на основании фармакологического действия вещества.

Материалы и методы

Для экспериментов использовались белые крысы самцы, массой 250-300 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария с соблюдением правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТЗ 51000.3-96 и 1000.4-96), а также правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях. Манипуляции над животными проводились с соблюдением правовых и этических норм после положительного заключения экспертизы Регионального этического комитета.

После премедикации хлоралгидратом (200 мг/кг, и.п.) животные были иммобилизированы в стереотаксической установке SR-5R-HT (Narishige Scintific Inctrument Lab, Япония). Животные были разделены на 3 группы. Опытным группам вводился карбамазепин в дозе 46 мг/кг, и.п. или фенобарбитал 85 мг/кг, и.п (дозы противосудорожных веществ являются эквивалентными по показателю TD50). Контрольная группа получала 0.3 мл дистиллированной воды (рисунок 1).

Рисунок 1. Дизайн исследования фармако-ЭЭГ после введения карбамазепина или фенобарбитала крысам

Для регистрации биопотенциалов крысам были подкожно установлены биполярно анкерные игольчатые электроды (custom made) из вольфрамо-сталистого сплава, диаметром 0,3 мм.  Локализация электродов: A1 – интерорбитально, медианно; P3 – интераурально, 4 мм латерально. Референсный электрод крепился к языку.

Запись сигнала проводилась с помощью лабораторного ЭЭГ-усилителя NVX36 (МКС, Россия) с частотой дискретизации 1000 Гц.  Данные экспортировались в формате BDF+ в разрешении 16 бит. Прибор был предварительно откалиброван синусоидным сигналом, амплитудой 100 мкв на частотах 1 и 10 Гц.

Порядок регистрации был адаптирован для эксперимента на общем основании с рекомендациями фармако-ЭЭГ исследований1. Процедура выполнялась в утренние часы с 9:00 до 13:00, не совпадая с периодами кормления животных, чтобы избежать влияния прандиальных и постпрандиальных реакций. ЭЭГ-регистрацию начинали через 30 мин. после введения антиконвульсивных средств или эквивалентного объема дистиллированной воды, продолжительность записи составляла 10 мин.

Анализ и обработка данных выполнялась на масштабируемых вычислительных серверах Amazon Elastic Compute Cloud.

Анализ данных

Рисунок 2. Обработка и анализ ЭЭГ-сигнала

Аббревиатуры: LPF – фильтр нижних частот; HPF – фильтр верхних частот; NF – notch-фильтр; DWT – discrete wavelet transform; PCA – principal component analysis; CNN – сверточная нейронная сеть; RNN – рекуррентная нейронная сеть; MLP – многослойный перцептрон; SVM – метод опорных векторов.

Были протестированы различные комбинации методов анализа и обработки ЭЭГ (рисунок 2):

  • А. 1 – 2  – идентификация транзиентных событий2 на фоне действия антиконвульсивных средств;
  • B. 1 – 3 – спектральный анализ ЭЭГ3;
  • C. 1 – 5 – классификация ЭЭГ с минимальной предобработкой при помощи алгоритмов машинного обучения4;
  • D. 1 – 3 – 5 – классификация ЭЭГ при помощи алгоритмов машинного обучения с предварительным выделением признаков (таблица 1);
  • E. 1 – 3 – 4 – 5 – классификация ЭЭГ при помощи алгоритмов машинного обучения с предварительным выделением и отбором признаков 5
Таблица 1. Признаки ЭЭГ характеристик расстройств сна
НазваниеФормулаСсылка
1Частотная энтропияЧастотная энтропия678
2Частота спектральной границыЧастота спектральной границы910
3Энтропия амплитудЭнтропия амплитуд1112
4Первый спектральный моментПервый спектральный момент13
5Спектральная центроидаСпектральная центроида1415
6Частотная ровностьЧастотная ровность16
7Энергия сигналаЭнергия сигнала17
8Оператор энергии Тигера-КайзераОператор энергии Тигера-Кайзера1819
9-13Относительные спектральные мощности δ, θ, ɑ, σ, β ритмов202122
14-18Отношения спектральных мощностей:σ/θ, σ/lowɑ, σ/β, ɑ/δ+θ, θ/ɑ+δ232425
Гармонические параметры262728
19Центральная частотаЦентральная частота
20Полоса пропусканияПолоса пропускания
21Значение на центральной частотеЗначение на центральной частоте
Параметры Юрта2930
22Активность ЮртаАктивность Юрта
23Мобильность ЮртаМобильность Юрта
24Сложность ЮртаСложность Юрта
Анализ энергетических спектров31
25Спектральная плотность мощностиСпектральная плотность мощности
26Спектральная амплитудаСпектральная амплитуда
Амплитудно-периодометрический анализ3233
27Выпрямленная амплитудаВыпрямленная амплитуда
28Время в ритмеВремя в ритме
Другие признаки
29Средняя спектральная частота34
30Плотность сонных веретен35
31Коэффициенты вейвлет (wavelet) преобразования36
32Коэффициенты авторегрессионной модели3738

Результаты

Полученные ЭЭГ данные были переконвертированы в формат .edf. 

На рисунке 3 изображен сигнал во временном домене. Введение изучаемых веществ привело к качественному изменению биоэлектрической активности мозга крыс. Отмечается доминирование относительно нерегулярного медленного дельта-ритма (1-4 Гц), что соответствует гипнотическому состоянию, вызванному как хлоралгидратом, так и фенобарбиталом. ЭЭГ, на которых визуально идентифицировались регулярные дыхательные артефакты были исключены из исследования.

Нажмите, чтобы увеличить

Регистрация электроэнцефалограммы через 30 минут после введения TD50 фенобарбитала и.п.

Рисунок 3. ЭЭГ на фоне действия фенобарбитала (нажмите для увеличения)

На рисунке 4 представлена ЭЭГ после введения карбамазепина, где наблюдаются аналогичные изменения биоэлектрического сигнала.

Нажмите, чтобы увеличить

Регистрация электроэнцефалограммы через 30 минут после введения TD50 карбамазепина и.п.

Рисунок 4. ЭЭГ на фоне действия карбамазепина

При расчете количественных характеристик ЭЭГ, по сравнению с группой контрольных животных у крыс, получавших карбамазепин и фенобарбитал, мощность сигнала в диапазоне дельта-частот возросла на 30%, мощность тета-ритма (4-8 Гц) увеличилась на 33%. Статистически значимые изменения в рамках альфа- (8-14 Гц) и бета-частот (14-30 Гц) не выявлены. 

Таблица 2.  Изменения ЭЭГ у крыс под влиянием фенобарбитала и карабамазепина

ГруппаДельта-ритм, мкВ^2Тета-ритм, мкВ^2Альфа-ритм, мкВ^2Бета-ритм, мкВ^2
Контроль14,47 ± 2,654,12 ± 1,122,27 ± 0,862,13 ± 0,48
Фенобарбитал18,95 ± 3,29*6,14 ± 1,48*2,42 ± 0,821,93 ± 0,87
Карбамазепин17,34 ± 2,95*6,02 ± 1,53*2,38 ± 0,951,97 ± 0,79
Примечание: * – статистические значимые различия (p<0,05)

При сравнении ЭЭГ спектрограмм  после введения фенобарбитала и карбамазепина (рисунок 5) в распределении мощности существенных различий между группами, получавшими антиконвульсивные препараты, не выявлено. Также отсутствуют пики мощностей основных ритмов. Спектральный анализ наглядно отражает преобладание низких частот, что характерно для состояния глубокой наркотизации, индуцированного хларалгидратом и противосудорожными средствами.

Рисунок 5. Спектральная плотность мощности

Примечание: А – распределение мощности для фенобарбитала (TD50, и.п.) на фоне действия хлоралгидрата 200 мг/кг, и.п.; Б – распределение мощности для карбамазепина (TD50, и.п.) на фоне действия хлоралгидрата 200 мг/кг, и.п. Регистрация через 30 мин. после введения веществ.

Таким образом, классический спектральный анализ не позволяет выявить эксплицитные различия и дифференцировать эффекты карбамазепина и фенобарбитала по сигналу ЭЭГ с достаточной степенью достоверности. 

Для выявления транзиентных событий в электроэнцефалограмме был выполнен фрактальный анализ. В случае наличия транзиентной динамики во временном ряде ЭЭГ можно выявить частично-детерминированные компоненты, которые могут быть формализованы, выделены как дистинктивные признаки и автоматически идентифицированы. Определение фрактальной размерности было выполнено по алгоритму Katz с эвристически рассчитанным пороговым значением 0,65.

По результатам проведенного фрактального анализа можно заключить, что в пределах временного ряда, продолжительностью в 1 минуту, сигнал ЭЭГ на фоне действия хлоралгидрата и изучаемых противосудорожных веществ сохраняет стационарные и стохастические свойства, если исключить из внимания эпизодические артефакты различного генеза.

Следующим шагом сигнал был преобразован в частотно-временной домен по методу вейвлета Морле (интерактивная фигура 1 и 2).

При сравнении вейвлетных спектров ЭЭГ на фоне действия карбамазепина отмечается большая пиковая амплитуда модулирующей кривой с меньшей частотой и регулярностью, по сравнению с фенобарбиталом. Наряду с этим в спектрограмме ЭЭГ карбамазепина выявляются характерные пики модуляции в диапазоне низких частот, которые отсутствуют в ЭЭГ группы фенобарбитала. Также вейвлетные спектры опытных животных имеют заметные визуальные различия по сравнению с контрольной группой, получавших только хлоралгидрат, при этом большее сходство АЧХ наблюдается с группой фенобрабитала, что объясняется общностью механизма действия хлоралгидрата и фенобарбитала, связанного с активацией ГАМК-эргической системы.

r-wavelet-phb
Фенобарбитал
r-wavelet-control
Контроль
resize-horizontal

Интерактивная фигура 1. Сравнение вейвлетного спектра группы фенобарбитала с контролем (наведите курсор)

r-wavelet-cbz
Карбамазепин
r-wavelet-control
Контроль

Интерактивная фигура 2. Сравнение вейвлетного спектра группы карбамазепина с контролем (наведите курсор)

Для качественной оценки значимости различий ЭЭГ на фоне действия фенобарбитала и карбамазепина были проведены заключительные этапы анализа с выделением признаков и применением алгоритмов машинного обучения.

Список обозначений: F – признаки из таблицы 1; MLP – многослойный перцептрон; SVM – метод опорных векторов; PCA – метод главных компонент; DS – даунсемплинг; LDA – линейный дискриминантный анализ; AR – удаление артефактов; DWT – дискретное вейвлет-преобразование; CNN – сверточная нейронная сеть; RNN – рекуррентная нейронная сеть.

Используя генерализованные характеристики ЭЭГ в качестве входных параметров для SVM и MLP удалось достигнуть уровня точности классификации 65 и 66% соответственно, при этом результаты SMV отличались более высокой положительной предсказательной ценностью, тогда как SMV обладал большей чувствительностью.

Снижение размерности первичных данных ЭЭГ с помощью PCA и LDA существенно повысило точность результатов (p<0,05) , однако предварительный даунсемплинг не отразился на точности.

Напротив, предварительное снижение размерности данных с помощью дискретного вейвлет-преобразования и даунсемплинга снизило точность результатов классификации сверточной нейронной сети, что говорит о значительных объемах потерь информации на этапе извлечения и отбора признаков.  Примечателен факт, что удаление артефактов также отразилось отрицательно на показателе точности, вероятно, потому что некоторые артефакты могут нести позитивную информацию о фармакологическом действии вещества, которое может находить отражение в сердечных, глазодвигательных, дыхательных и некоторых других артефактах.

Наибольшая точность результатов (97% и 98% соответственно) достигнута с помощью сверточных и рекуррентных нейронных сетей, которые, в отличие от PCA и LDA, позволяют эффективно выявлять сложные нелинейные взаимосвязи в биоэлектрической активности мозга как во временном, так и в частотном домене. Данные архитектуры способны работать с большими объемами входных данных при относительно низких вычислительных затратах, не требуют предобработки и снижения размерности данных.

Заключение

Впервые изучена возможность качественной идентификации фармакологического действия веществ по биоэлектрической активности мозга с помощью методов машинного обучения. Показана перспективность и высокая эффективность данного подхода.

На основе полученных результатов, сформулированы экспериментальные проблемы и предложены решения.

ПроблемаРешение
Наркоз (хлоралгидрат) вносит значительные искажения в ЭЭГХроническая внутричерепная имплантация электродов
Пространственная оценка биоэлектрической активностиИспользование большего количества каналов (21)
Оптимальный уровень дискретизацииСемплинг с максимальной частотой 5кГц
Количественная и динамическая оценка эффекта соединенияРегистрация от момента введения вещества (норма) до полного развития эффекта. Изучение возрастающих доз соединения.
Поляризация электродовСравнительная оценка с неполяризующимися электродами
Недостаточное количество классовУвеличение числа фармакологических групп
Индивидуальные различия ЭЭГОценка вклада индивидуальных различий (“разные вещества – разные особи” и “разные вещества – одна особь”). Отбор животных с более высокими предсказательными свойствами.

 

II итерация

Следующий этап исследования посвящен анализу проблематики текущего этапа, оптимизиации экспериментальной модели, выявлению фундаментальныx закономерностей формирования биоэлектрической активности мозга на фоне действия фармакологических веществ.

Footnotes

  1. https://www.karger.com/Article/FullText/343478
  2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6157576/
  3. https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnhum.2015.00708/full
  4. https://www.researchgate.net/publication/226608201_Model_Comparison_for_the_Detection_of_EEG_Arousals_in_Sleep_Apnea_Patients
  5. Muhammad, B., Jusof, M. F. M., Shapiai, M. I., Adam, A., Yusof, Z. M., Azmi, K. Z. M., ... & Mokhtar, N. (2018, May). Feature selection using binary simulated Kalman filter for peak classification of EEG signals. In 2018 8th International Conference on Intelligent Systems, Modelling and Simulation (ISMS) (pp. 1-6). IEEE.
  6. Fell J. et al. Discrimination of sleep stages: a comparison betweenspectral and nonlinear EEG measures //Electroencephalography and clinicalNeurophysiology. – 1996. – Т. 98. – №. 5. – С. 401-410.
  7. Löfhede J. et al. Automatic classification of background EEG activity inhealthy and sick neonates //Journal of neural engineering. – 2010. – Т. 7. – №. 1. – С.016007.
  8. Inouye T. et al. Quantification of EEG irregularity by use of the entropyof the power spectrum //Electroencephalography and clinical neurophysiology. –1991. – Т. 79. – №. 3. – С. 204-210.
  9. Fell J. et al. Discrimination of sleep stages: a comparison between spectral and nonlinear EEG measures //Electroencephalography and clinical Neurophysiology. – 1996. – Т. 98. – №. 5. – С. 401-410.
  10. Löfhede J. et al. Automatic classification of background EEG activity in healthy and sick neonates //Journal of neural engineering. – 2010. – Т. 7. – №. 1. – С. 016007.
  11. Fell J. et al. Discrimination of sleep stages: a comparison between spectral and nonlinear EEG measures //Electroencephalography and clinical Neurophysiology. – 1996. – Т. 98. – №. 5. – С. 401-410.
  12. Zoubek L. et al. Feature selection for sleep/wake stages classification using data driven methods //Biomedical Signal Processing and Control. – 2007. – Т. 2. – №. 3. – С. 171-179.
  13. Fell J. et al. Discrimination of sleep stages: a comparison between spectral and nonlinear EEG measures //Electroencephalography and clinical Neurophysiology. – 1996. – Т. 98. – №. 5. – С. 401-410.
  14. Löfhede J. et al. Automatic classification of background EEG activity in healthy and sick neonates //Journal of neural engineering. – 2010. – Т. 7. – №. 1. – С. 016007.
  15. Cvetkovic D., Cosic I. Sleep onset estimator: evaluation of parameters //Engineering in Medicine and Biology Society, 2008. EMBS 2008. 30th Annual International Conference of the IEEE. – IEEE, 2008. – С. 3860-3863.
  16. Löfhede J. et al. Automatic classification of background EEG activity in healthy and sick neonates //Journal of neural engineering. – 2010. – Т. 7. – №. 1. – С. 016007.
  17. Álvarez-Estévez D., Moret-Bonillo V. Model comparison for the detection of EEG arousals in sleep apnea patients //International Work-Conference on Artificial Neural Networks. – Springer, Berlin, Heidelberg, 2009. – С. 997-1004.
  18. Kaiser J. F. Some useful properties of Teager's energy operators //Acoustics, Speech, and Signal Processing, 1993. ICASSP-93., 1993 IEEE International Conference on. – IEEE, 1993. – Т. 3. – С. 149-152.
  19. Ahmed B., Redissi A., Tafreshi R. An automatic sleep spindle detector based on wavelets and the teager energy operator //Engineering in Medicine and Biology Society, 2009. EMBC 2009. Annual International Conference of the IEEE. –IEEE, 2009. – С. 2596-2599.
  20. Van Hese P. et al. Automatic detection of sleep stages using the EEG //Engineering in Medicine and Biology Society, 2001. Proceedings of the 23rd Annual International Conference of the IEEE. – IEEE, 2001. – Т. 2. – С. 1944-1947.
  21. Zoubek L. et al. Feature selection for sleep/wake stages classification using data driven methods //Biomedical Signal Processing and Control. – 2007. – Т.2. – №. 3. – С. 171-179.
  22. Estrada E. et al. EEG feature extraction for classification of sleep stages //Engineering in Medicine and Biology Society, 2004. IEMBS'04. 26th Annual International Conference of the IEEE. – IEEE, 2004. – Т. 1. – С. 196-199.
  23. Huupponen E. et al. Automatic analysis of electro-encephalogram sleep spindle frequency throughout the night //Medical and Biological Engineering and Computing. – 2003. – Т. 41. – №. 6. – С. 727-732.
  24. Huupponen E. et al. Comparison of fuzzy reasoning and autoassociative MLP in sleep spindle detection //Signal Processing Conference, 2000 10th European.– IEEE, 2000. – С. 1-4.
  25. Agarwal R., Gotman J. Computer-assisted sleep staging //IEEE Transactions on Biomedical Engineering. – 2001. – Т. 48. – №. 12. – С. 1412-1423.
  26. Van Hese P. et al. Automatic detection of sleep stages using the EEG //Engineering in Medicine and Biology Society, 2001. Proceedings of the 23rd Annual International Conference of the IEEE. – IEEE, 2001. – Т. 2. – С. 1944-1947.
  27. Estrada E. et al. EEG feature extraction for classification of sleep stages //Engineering in Medicine and Biology Society, 2004. IEMBS'04. 26th Annual International Conference of the IEEE. – IEEE, 2004. – Т. 1. – С. 196-199.
  28. Tang W. C. et al. Harmonic parameters with HHT and wavelet transform for automatic sleep stages scoring //REM. – 2007. – Т. 365. – С. 8-6.
  29. Hjorth B. EEG analysis based on time domain properties //Electroencephalography and clinical neurophysiology. – 1970. – Т. 29. – №. 3. – С.306-310.
  30. Van Hese P. et al. Automatic detection of sleep stages using the EEG //Engineering in Medicine and Biology Society, 2001. Proceedings of the 23rd Annual International Conference of the IEEE. – IEEE, 2001. – Т. 2. – С. 1944-1947.
  31. GEERING B. A. et al. Period‐amplitude analysis and power spectral analysis: a comparison based on all‐night sleep EEG recordings //Journal of sleep research. – 1993. – Т. 2. – №. 3. – С. 121-129.
  32. GEERING B. A. et al. Period‐amplitude analysis and power spectral analysis: a comparison based on all‐night sleep EEG recordings //Journal of sleep research. – 1993. – Т. 2. – №. 3. – С. 121-129.
  33. Uchida S. et al. A comparison of period amplitude analysis and FFT power spectral analysis of all-night human sleep EEG //Physiology & behavior. –1999. – Т. 67. – №. 1. – С. 121-131.
  34. Huupponen E. et al. Development and comparison of four sleep spindle detection methods //Artificial intelligence in medicine. – 2007. – Т. 40. – №. 3. – С.157-170.
  35. Huupponen E. et al. Automatic analysis of electro-encephalogram sleep spindle frequency throughout the night //Medical and Biological Engineering and Computing. – 2003. – Т. 41. – №. 6. – С. 727-732.
  36. Zoubek L. et al. Feature selection for sleep/wake stages classification using data driven methods //Biomedical Signal Processing and Control. – 2007. – Т.2. – №. 3. – С. 171-179.
  37. Zhovna I., Shallom I. D. Automatic detection and classification of sleep stages by multichannel EEG signal modeling //Engineering in Medicine and Biology Society, 2008. EMBS 2008. 30th Annual International Conference of the IEEE. –IEEE, 2008. – С. 2665-2668.
  38. Acır N., Güzeliş C. Automatic recognition of sleep spindles in EEG by using artificial neural networks //Expert Systems with Applications. – 2004. – Т. 27.– №. 3. – С. 451-458.