Научные методы исследования головного мозга

Используя научный метод и проводя эксперименты, мы можем исследовать анатомические и функциональные особенности головного мозга человека и животных.  Исследования головного мозга исходят из того, что основной морфофункциональной единицей головного мозга является нейрон с его активностью, а не более крупные структуры. При этом функции мозга (эмоции, память, психика) должны рассматриваться не только исходя из структуры разных типов нервных клеток, но и из их взаимодействия.

В зависимости от того на что направлен метод их можно разделить на электрофизиологические, методы регистрирующие электрическую активность мозга; оптические методы использующие микроскопические подходы, либо отслеживающие метаболические процессы, которые могут усиливаться или ослабляться в зависимости от активности мозга, после чего мы визуализируем структуры с наибольшей активностью; методы, позволяющие воздействовать непосредственно на сам мозг, например, используя стимуляцию или вживляя в нейроны новые типы рецепторов.

Все эти методы можно распределить относительно в пространственного и временного масштаба. В пространственном масштабе рассматривается работа мозга начиная от самих мелких его структур, например, синапсов, до работы целого мозга. Под временным масштабом понимается какие по времени сигналы, от миллисекунд до месяцев, метод позволяет регистрировать во время работы мозга, в частности нейронов.

Современные методы исследований


Распределение современных методов исследования головного мозга в пространственно-временном масштабе

Электофизиологические методы

Электроэнцефалография

Электроэнцефалография (ЭЭГ, англ. electroencephalography, EEG) — неинвазивный метод исследования функционального состояния головного мозга путём регистрации его биоэлектрической активности.

➥ Основаная статья: Электроэнцефалография

Достоинства:

  • Чувствительность;
  • Высокое временное разрешение;
  • Высокая проработанность метода.

Недостатки:

  • Низкое пространственное разрешение;
  • Чувствительность к движениям и тремору.

Таким образом, ЭЭГ хорошо подходит для исследования вопросов о скорости нейронной активности и хуже для исследования вопросов о местоположении такой активности.

Пример регистрации сигналов ЭЭГ, ЭКоГ и LFP

Электрокортикография (ЭКоГ)

➥ Основная статья: Электрокортикография

Электрокортикография –  это инвазивный способ электрофизиологического мониторинга активности нейронов, в основе которого лежит регистрация электрических потенциалов  с помощью суперкортикально (эпидурально или субдурально), интракортикально или субкортикально расположенных электродов.

Достоинства:

  • Гибкое размещение регистрирующих и стимулирующих электродов;
  • Может быть выполнена на любом этапе: до, во время и после операции;
  • Позволяет проводить прямую электростимуляцию головного мозга, выявляя критические участки коры, которых следует избегать во время операции;
  • Высокое временное и пространственное разрешение;
  • Отношение сигнал/шум лучше из-за более близкого расположения к нейронной активности.

Недостатки:

  • Ограниченное время выборки – пароксизмы (иктальные события) могут не записываться в течение периода записи ЭКоГ;
  • Ограниченное поля обзора – размещение электрода ограничено областью обнаженной коры и временем операции, возможны ошибки выборки;
  • Запись зависит от влияния анестетиков, наркотических анальгетиков и самой операции.

Регистрация потенциалов локального поля (Local field potentials)

Микроэлектродные методы регистрации биопотенциалов

Потенциалы локального поля – временные ритмические сигналы, возникающие в нервной ткани за счет суммации и синхронизации активности отдельных нейронов. Они генерируются за счет дисбаланса концентрации ионов вне клеток в результате электрической активности самих клеток. Это приводит к возникновению локального электрического поля в ограниченном пространстве, непосредственно прилегающем к возбужденным нейронам.

Достоинства:

  • Возможность регистрации активности в определенной области;
  • Возможность применения метода in vitro;

Недостатки:

  • Низкое разрешение.

Регистрация мультиюнитной активности (multiunit activity)

Метод регистрации нейронной активности, основанный на использовании электродов с большой площадью контакта, что позволяет наблюдать за целыми популяциями нейронов. Используется при невозможности  регистрации активности отдельных нейронов или для исследования отдельных нейронных ансамблей.

Достоинства:

  • Меньшая сложность исполнения по сравнению с SUA;
  • Возможность локализации спайка;
  • Возможность определения количества прилежащих клеток;
  • Локализация нейрональной активности.

Недостатки:

  • Низкое пространственное разрешение;
  • Большая степень травмирования по сравнению с SUA.

Регистрация активности одиночных нейронов (singleunit activity)

Метод, основанный на регистрации потенциалов действия отдельного нейрона системой микроэлектродов. Имплантированное в мозг устройство позволяет регистрировать скорость изменения напряжения во времени. Нашел широкое применение в анализе когнитивных способностей, картографировании коры головного мозга и в технологиях интерфейса мозг-компьютер.

Достоинства:

  • Высокое пространственное разрешение;
  • Низкая степень травмирования за счет малых размеров;
  • Широкий потенциал для практического применения.

Недостатки:

  • Высокая сложность исполнения;
  • Дороговизна оборудования.

Patch-clamp, метод локальной фиксации потенциала

➥ Основная статья: Patch clamp метод

Нейрон и микропипетка

Метод изучения свойств ионных каналов, основанный на изоляции фрагмента клеточной мембраны с помощью микропипетки. Позволяет контролировать разность потенциалов между сторонами мембраны и помещать ее в различные среды.

В электрофизиологии широкое распространение получил метод «Planar patch-clamp» – в  отличие от классического метода исследования, в данном случае не пипетка позиционируется на отдельной клетке, а клеточная суспензия наносится на микрочип с упорядоченными отверстиями субклеточного диаметра.

Достоинства:

  • Очень высокая чувствительность;
  • Возможность изучения свойств каналов в широком диапазоне условий;
  • Возможность исследования процессов на молекулярном уровне.

Недостатки:

  • Низкое пространственное разрешение – производится исследование отдельной клетки;

Потребность в мобилизации клеток посредством ферментов-протеаз, что может приводить к модификации ионных каналов.

Магнитоэнцефлография

Магнитоэнцефалография

Вверху посередине: магнитные поля после сенсорной стимуляции, где (а) показывает записанные данные, а (b) и (с) отображают остаточные магнитные поля, полученные после фильтрации сигналов соматосенсорной обработки от записанных данных. Вверху справа: исходные местоположения данных MЭГ, наложенных на изображения МРТ.

Магнитоэнцефалография (МЭГ, англ. magnetoencephalography, MEG ) — технология, позволяющая измерять и визуализировать магнитные поля, возникающие вследствие электрической активности мозга. Для детекции полей используются высокоточные сверхпроводниковые квантовые интерферометры, или СКВИД-датчики.

Достоинства:

  • Чувствительность;
  • Высокое временное разрешение – позволяет фиксировать процессы со временем протекания от 0,001 до 1 мс ;
  • Возможность клинического применения;
  • Высокое пространственное разрешение.

Недостатки:

  • Высокая стоимость оборудования;
  • Низкая чувствительность по отношению к подкорковым структурам;
  • Возможность возникновения помех из-за магнитного поля электронных устройств.

Оптические методы

Методы визуализации: два подхода к нейрофотонике – методу визуального исследования нейронов – это двухфотонная микроскопия и фиброоптическая микроскопия.

Двухфотонная и фиброоптическая микроскопия

Суть первого заключается во введении методами генной инженерии в клетки биологических сенсоров, реагирующих на изменение концентрации кальция вспышками света. После этого проводится трепанация черепа подопытного животного с заменой части кости стеклом. Животное закрепляется под микроскопом и помещается на подвижный шар, окруженный мониторами, образующими виртуальную реальность.

К отверстию в черепе подводится двухфотонный микроскоп, возбуждающий флуоресценцию только на определенном слое нейронов. 

Устройство минископа

Более инновационным является метод трехфотонной микроскопии. Она позволяет проводить наблюдение через интактный череп на всю глубину коры головного мозга.

Однако «Методом 2018 Года» по мнению журнала Nature Methods1 является визуализация активности нейронов головного мозга свободно передвигающегося животного с помощью мультифотонных минимикроскопов (минископов) на основе фемтосекундных лазеров, подключенных непосредственно к трепанированному черепу. Устройство монтируется на голову животного, а на поверхность мозга устанавливается линза, которая позволяет наблюдать за активностью нейронов в любом слое. Из светодиодов в мозг поступает излучение с определенной длиной волны, тем самым возбуждая светочувствительные клетки с вживленным рецептором. Световой сигнал поступает на чувствительную матрицу и переводится в электрические сигналы.

 Сравнительные характеристики современного минископов:

ХарактеристикиСовременный минископМинископ следующего поколения
ВысотаОт 22 ммОт 21 мм
Масса3 граммаМенее 2 грамм
Дата-кабельКоаксиальный кабель более 5 м длинойКоаксиальный кабель более 5 м длиной
Максимум FPS60От 120 до 480
Размеры поля видимости0.4 мм²От 1 до 3 мм²
УвеличениеОт 6х до 7хОт 2х до 3х
Средняя рабочая дистанция125 мкмОт 0.8 до 2 мм
Изменение рабочей дистанции+/- 125 мкм+/- 300 мкм
Площадь занимаемой на черепе поверхности75 мм²25 мм²
Визуализация и оптогенетика-+
Коммутатор++
Беспроводная технология++
Автофокус-+
Полная ахроматичность-+
Поддержка множественных фото-детекторов-+
Возможность структурной подсветки-+
Устройство современного минископа

Достоинства:

  • Высокое пространственное разрешение;
  • Высокое временное разрешение;
  • Возможность исследования нейронов в толще коры;
  • Возможность исследования слоя толщиной в одну клетку на любой глубине. 

Недостатки:

  • Инвазивность;
  • Потребность в создании генномодифицированных организмов;
  • Высокая сложность.

Кальциевый имиджинг

➥ Основная статья: Calcium imaging

Один из методов, позволяющих визуально определять момент активации нервной клетки благодаря т.н. кальциевым индикаторам.

Кальциевые индикаторы – молекулы веществ, чувствительных к ионам Са2+ и вызывающих флуоресценцию нейрона при связывании с ними.

Метод получил широкое распространение в связи с развитием оптогенетики. Его сущность состоит в введении в клетку производных EGTA (эгтазиновая кислота), обладающих специфичностью по отношению к ионам кальция и способностью флуоресцировать при связывании с ними.

Также возможно создание генномодифицированных животных, клетки которых вырабатывают белок GFP или его модификации. Данные протеины формируют постоянную флуоресцирующую метку в активных нейронах.

Достоинства:

  • Высокое пространственное разрешение;
  • Высокое временное разрешение;
  • Возможность использования как для отдельных клеток, так и для целого организма.

Недостатки:

  • Является вспомогательным методом для оптогенетики;
  • Регистрация только одного типа ионов.

Функциональная магнитно-резонансная томография

Функциональная магнитно-резонансная томография

Сначала 30 секунд пациент смотрит на изображение на мониторе затем на 30 секунд закрывает глаза

Один из видов МРТ, проводимый с целью регистрации изменений тока крови в головном мозге. Основан на разнице в магнитных свойствах оксигенированого и дезоксигенированого гемоглобина. Дает возможность установить связь активности нейронов в задействованной области с показателями кровотока в ней. Данный метод позволяет определить активную в момент выполнения того или иного действия зону головного мозга.

Достоинства:

  • Неинвазивность;
  • Широкая доступность;
  • Высокое клиническое значение.

Недостатки:

  • Низкое пространственное разрешение;
  • Низкое временное разрешение;
  • Сильная зависимость результатов от внешних воздействий.

Позитронно-эмиссионная томография

Позитронно эмиссионная томография мозга

Метод томографии, основанный на регистрации пары гамма-квантов, возникающих при аннигиляции позитронов с электронами. С целью исследования в исследуемый организм вводится радиофармпрепарат, после чего производится облучение бета-радиацией, в результате чего происходит распад радионуклидов. Последующая аннигиляция образовавшихся позитронов порождает два гамма-кванта с одинаковой энергией, разлетающихся в противоположные стороны по одной прямой. Детекторы, расположенные вокруг объекта регистрируют сигналы, а последующая компьютерная обработка полученных данных позволяет сформировать трехмерную модель распределения радионуклидов в объекте.

Достоинства:

  • Неинвазивность;
  • Наглядность;
  • Высокое пространственное и временное разрешение;
  • Высокая скорость выполнения.

Недостатки:

  • Использование радиоактивных веществ;

Низкая продолжительность исследования в связи с распадом радиопрепаратов.

Визуализация с использованием 2-дезокси-D-глюкозы

Данный метод основан на введении в организм молекул 2-дезоксиглюкозы, меченных тритием или углеродом-14, что позволяет регистрировать распределение глюкозы в организме методом радиографии. Также используется в качестве визуализирующего агента в позитронно-эмиссионной томографии.

Достоинства:

  • Высокое пространственное и временное разрешение;

Недостатки:

  • Является вспомогательным методом для позитронно-эмиссионной томографии;
  • Использование радиоактивных веществ.

VSD имиджинг

VSD имиджинг

A - Молекулы красителя локализуются в мембранах с их гидрофобными хвостами и оптически отображают мембранные потенциалы. B - VSD оптические изображения, показывающие изменения флуоресценции после стимуляции усов мыши. Начало стимула было в на первом кадре, время после начала стимула указано в левом нижнем углу каждого изображения.

VSD (Voltage-sensitive dyes) или потенциометрическое окрашивание – метод исследования мозговой активности, основанный на введении красителей, изменяющих свой цвет под действием электрического тока. Данный метод позволяет определить место возникновения потенциала действия, его скорость и направление распространения.

Достоинства:

  • Широта охвата – данный метод позволяет наблюдать за активацией целых популяций нейронов;
  • Обратимость – возможность удаления красителей;
  • Возможность регистрации пути прохождения сигнала.

Недостатки:

  • Лабильность красителей под действием ряда препаратов;
  • Неспособность проникать через клетки соединительной ткани (частично преодолена современными красителями);
  • Существует вероятность негативного влияния на клетки;
  • Относительно невысокое разрешение получаемых результатов.

Методы, позволяющие вмешиваться непосредственно в работу самого мозга

Транскраниальная магнитная стимуляция

➥ Основная статья: Транскраниальная магнитная стимуляция

Метод основан на стимуляции нейронов коры головного мозга короткими магнитными импульсами, что вызывает возбуждение ингибиторных нейронов. Регистрация результатов осуществляется электромиографически благодаря сокращению соответствующих периферических мышц согласно их топографическому представительству в коре.

Достоинства:

  • Неинвазивность;
  • Возможность применения в клинической практике.

Недостатки:

  • Чувствительность к изменениям магнитного поля;
  • Зависимость результатов воздействия и от выраженности ингибиторной активности коры, и от интенсивности стимуляции;
  • Неоднозначность результатов клинических исследований.

Хемогенетика

Хемогенетика

Схематический обзор того, как различные виды DREADD (hM3Dq и hM4Di) могут быть использованы для активации, а также ингибирования групп нейронов с использованием CNO. Также показано ингибирующее действие ахетилхолина (ACh) на CNO. ЗФБ - зелёный флуоресцентный белок CNO - клозапин-N-оксид

Суть данного метода заключается во вживлении в отдельные нервные клетки животного новых, ранее не существовавших у него рецепторов, чувствительных к строго определенному соединению, для избирательной активации данных нейронов. Важно отметить, что используемое соединение не должно оказывать физиологического воздействия на прочие клетки.

Данный метод получил название «Создание DREADD-рецепторов», где DREADD – designer receptors exclusively activated by designer drugs – специальные рецепторы, избирательно чувствительные к созданным препаратам. С помощью их селективной экспресии можно направленно изменять активность разных типов клеток и популяций нейронов в мозге.

Достоинства:

  • Отсутствие побочных воздействий используемых препаратов;
  • Избирательность действия;
  • Неинвазивность.

Недостатки:

  • Потребность в создании новых препаратов для проведения исследований;
  • Узкий спектр возможного применения для созданных препаратов;
  • Потребность в использовании методов генной инженерии.

Оптогенетика

Оптогенетическая стимуляция

Синий свет избирательно активирует нейроны с канальным родопсином-2 (ChR2).

Суть заключается в создании трансгенного организма, в мембранах нейронов которого находятся светочувствительные рецепторы, влияющие на открытие или закрытие ионных каналов, тем самым вызывая процессы возбуждения или торможения. Возможна широкая вариация свойств рецепторов – от локализации в конкретных клетках и условий синтеза белка до восприимчивости к определенной длине волны.

Для неинвазивного вмешательства возможно применение конструктов с красным смещением. Это достигается путем применения света с длиной волны, обеспечивающей его прохождение через ткани – обычно 630-760 нм.

Достоинства:

  • Точность – возможна активация отдельных нейронов;
  • Высокое разрешение;
  • Широкий диапазон воздействий.

Недостатки:

  • Высокая сложность метода;
  • Инвазивность.

Микростимуляция

Микростимуляция – инвазивный метод, основанный на введении в кору головного мозга микроэлектродов и стимуляции отдельных ее клеток или участков.

Достоинства:

  • Высокая точность метода;
  • Наглядность;
  • Возможность клинического применения;
  • Возможность прямого изучения функций отдельных клеток или участков.

Недостатки:

  • Инвазивность;
  • Высокая сложность исполнения.

Математическое моделирование с использованием нейросетей

Визуальное отображение математического моделирования активности нервных клеток в головном мозге

Данный метод основан на построении карт месторасположения нейронов и путей прохождения сигнала при определенных видах деятельности и выделении из них характерных паттернов, что позволяет прогнозировать поведение и намерения. Его предполагается использовать для взаимодействия с людьми, потерявшими способность двигаться.

Сочетание методов минископии и обработки данных нейронными сетями позволяет получать карты активности нейронов головного мозга.

Анализ мозговой активности при оптомоторном ответе рыбы-зебры

На иллюстрации изображен мозг рыбы-зебры, где выделены все нейроны, участвующие в движении вперед (зеленый цвет на крайнем левом изображении или белый цвет на крайнем правом), движении назад (зеленый цвет на центральном изображении или синий на крайнем правом) и непосредственно плавании (розовый или красный цвета).

Сочетание методов оптогенетики и внешнего стимула

На следующей иллюстрации изображено сочетание методов оптогенетики с внешним воздействием. Суммарно это позволяет увидеть сеть всех нейронов, отвечающих за реакцию на раздражитель. Суть работы, из которой взята иллюстрация, заключалась в наблюдении за этой сетью с последующим удалением ее частей для выделения базовой структуры мозга, определяющей активность, возникающую в ответу на внешний раздражитель.2

Развиваются и методы МРТ. Их эволюция связана с увеличением индукции магнитного поля с 1.5 Тл (наиболее распространенный на данный момент стандарт) до 10.5 или даже 11.5 Тл (экспериментальные установки в США и во Франции, запуск которых запланирован на 2018 и 2022 год соответственно).

Был создан метод, получивший название «Zip-Zap стимуляция», который позволил устанавливать факт бодрствования человека посредством обнаружения осцилляций на высокоплотной ЭЭГ или МЭГ после интракраниальной магнитной стимуляции. Высокая скорость затухания и малая область захвата данных отклонений свидетельствует о нахождении человека в состоянии сна, наркоза или комы. Практически данный метод предполагается использовать для больных, находящихся в пограничном состоянии для заключения об их статусе.

Footnotes

  1. Method of the Year 2018: Imaging in freely behaving animals. Nat Methods 16, 1 (2019). DOI: 10.1038 s41592-018-0292-8
  2. Vladimirov, N., Wang, C., Höckendorf, B. et al. Brain-wide circuit interrogation at the cellular level guided by online analysis of neuronal function. Nat Methods 15, 1117–1125 (2018). DOI: 10.1038/s41592-018-0221-x